IPS诱导肠类器官的培养过程可分为三个主要阶段：人类多能干细胞的培养、内胚层的分化与中后肠的模式化诱导、以及类器官的培养。本文将集中讨论第三个阶段，即类器官培养（14-28天）。

在类器官培养的准备工作中，使用必要的试剂和耗材，包括人正常肠类器官培养试剂盒、低因子无酚红基质胶、离心管、细胞培养板及金属冰盒。各个组分的规格和使用要求详细列出，以确保实验的顺利进行。

一、准备工作

所需试剂和耗材：

• 人正常肠类器官培养试剂盒 (abs9545)
• 基质胶（低因子、无酚红） (abs9495)
• 15ml离心管 (abs7102)
• 15ml EP管若干 (abs7119)
• 24孔细胞培养板 (abs7035)
• 金属冰盒

二、操作流程

1. 加胶-点板-加液

该过程是原代操作的关键步骤。首先，将基质胶在4℃冰盒中融化并预冷所需的离心管和枪头。接着，在24孔板中，每孔加入25μL基质胶和500-750μL的类器官培养基，推荐的接种密度为基质胶与球状体的体积比为25:1，以保证细胞团的良好沉淀。

在整个操作过程需要避免产生气泡，因此在点板过程中，务必在金属冰盒或冰上操作，并控制在半分钟内，确保基质胶流畅。

2. 类器官传代

传代步骤依据类器官的数量和体积进行调整，主要分为两种情况：

1. 类器官数量较多或体积较大：收集和洗涤类器官，使用4℃的传代培养缓冲液轻柔吹散基质胶，随后进行离心。分离清晰的类器官沉淀后，再进行消化和复苏。
2. 类器官数量不足或体积较小时：分享相似步骤，但重心在于使用较少的基质胶，同时增加富集孔的数量以维持生长所需的旁分泌信号。

三、冻存与复苏

类器官的冻存要求是确保在指数增长时期进行，并且在冻存过程中不需消化类器官，以提高复苏率。在收集和洗涤类器官之后，使用适量的冻存液进行重悬，并在适宜的温度下进行梯度冻存，确保类器官的存活。

复苏步骤

在解冻过程中，务必快速完成，同时在水浴锅中摇动以加快融化。进一步将冻存液移入离心管中，添加传代培养缓冲液并进行轻柔混匀，再进行离心以去除上清。

最后，将重悬的细胞与基质胶混合，添加养分丰富的培养基，并在适宜的条件下培养直至达到最佳增殖状态。整个过程中的注意事项包括操作的无菌性和细胞融合度的控制。

遵循这些精确的步骤并优化操作细节，能够有效生成功能性人类肠道类器官，广泛应用于疾病建模、药物筛选等生物医疗领域，让我们在科学探索中不断前行，实现更多的突破与创新。随着人生的博弈，尊龙凯时将始终为您提供优质的生物试剂与服务，加速您的研究进程。

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