胎牛血清的常规储存温度为-20℃,如需长期保存,可以在-80℃下储存。解冻时建议避免直接放在常温(25-37℃)中,因这可能导致絮状沉淀的产生,从而影响血清的品质。最佳的解冻方法是先将其从-20/-80℃转移到4℃,待全部变为液态后再转至室温。在此过程中,应不时摇动血清,以使其内成分及温度均匀混合,帮助减少沉淀的形成。
解冻后,胎牛血清可分装于无菌的15mL或50mL离心管中,按照使用频率于4℃存放已经解冻的血清,以方便频繁配制培养基。然而,4℃下也不应存放过久,最好在一个月内使用完毕。需注意,解冻后的胎牛血清不宜在37℃或室温下存放太久,以避免重要细胞生长因子的失活,影响细胞状态。
原则上,血清的添加量不应过多,通常添加5%、10%或20%。大多数细胞在正常培养中使用10%血清浓度,某些细胞在原代提取时使用20%血清。具体的血清浓度需根据细胞特性和实验目的进行探索。
另外,热灭活是一个重要的步骤,通常在56℃下处理已解冻的血清30分钟,以去活化补体,补体参与的反应包括溶细胞活性、平滑肌收缩、肥大细胞和血小板组胺释放、增强吞噬作用和淋巴细胞、巨噬细胞的趋化激活。虽然有一些特殊实验要求需要热灭活,但对于大多数常规细胞培养来说,这并不是必须的步骤。经过热处理的血清可能会对细胞生长产生负面影响,减少其增长速率,甚至增加沉淀物。
在细胞培养中,经常需要更换血清。如果直接将另一款血清配制的培养基应用于细胞,可能会导致原本生长迅速的细胞突然减缓甚至脱壁死亡。这通常是由于细胞对原有培养环境的适应所致,突然更换新的营养环境,即使是质量更好的血清,也可能引发不适应。因此,在更换血清时,建议采取梯度替换的方式,以帮助细胞逐渐适应新环境。当使用血清进行细胞复苏时,建议采用原培养体系,让细胞状态恢复后再进行任何测试。在测试过程中,逐步替换新旧血清的比例,如首次按1:3替换,第二次1:1,第三次3:1,之后完全替换。
若在解冻后观察到少量乳白色的絮状或点状物体,这通常是血清中脂蛋白的变性或纤维蛋白造成的,这些现象不会影响血清的整体质量。可以利用400×g离心5分钟以分离沉淀物,基本上不会对细胞产生重大影响。
一般情况下,厂家提供的血清为无菌,无需再进行过滤去菌。如果发现血清中有悬浮物,建议将血清与培养液一起过滤,而不要直接过滤血清。
在细胞培养过程中,如果观察到黑点的出现,首先需用肉眼检查培养基是否混浊,黑点是否不规则游动。如果细胞被污染,微生物可能会大量繁殖,导致培养基迅速变黄和混浊。污染可能来源于细菌或支原体。如果在显微镜下观察细胞生长状态良好,与黑点出现前相比没有变化,则黑点可能由以下几种情况引起:(1) 细胞生长过程中自然破碎的细胞残骸;(2) 血清中的杂蛋白,可能是反复冻融的结果;(3) 配制培养基的水质和容器不合格。可以通过离心或过滤的方法去除黑点;(4) 原代细胞中的小黑点或与原代组织中的杂质有关,多次传代可以消除。
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